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1815年3月13日、米国ペンシルベニア州ミルトンに生まれた。プリンストン大学、ペンシルベニア大学医学部を卒業。一度は清国（中国）への宣教医師として渡航したが妻の健康のため帰国、ニューヨークで医師として成功。1859年、米国長老派教会の宣教師として妻クララとともに来日、横浜に定住した。当時キリスト教は禁教下にあったため、施療所を開き無料で治療しつつ宣教の機会を待った。言語学者としても傑出し、1867年、日本初の本格的和英辞典『和英語林集成』を出版。この辞典に用いた日本語のローマ字表記法が後に「ヘボン式ローマ字」と呼ばれ、現代日本語ローマ字表記の基礎となった。新約聖書・旧約聖書の日本語翻訳（明治元訳聖書）にも主導的役割を果たした。1863年に開いた「ヘボン塾」は後に明治学院（現・明治学院大学）の源流となった。1892年、33年間の日本滞在を終え米国に帰国。1911年、ニュージャージー州イーストオレンジで95歳で没。

医師・宣教師・言語学者・教育者を兼ね備えた類まれな全方位型知識人。謙虚で勤勉、自らの名を誇らず日本人のために生涯を捧げた。「宣教より前にまず医療」と実践を重視し、無料診療で数万人の日本人を救った。敬虔なキリスト者にして、日本文化への深い敬意を持ち、漢字・日本語の体系的研究にも心血を注いだ。

ヘボン式ローマ字は現代日本のパスポート・道路標識・国際文書で公式に使われ続け、日本語と世界を繋ぐ架け橋となった。『和英語林集成』は第3版（1886年）まで版を重ね、日本語学の古典として現在も研究される。明治学院は横浜バンド（日本プロテスタント三源流の一つ）の拠点となり、島崎藤村ら明治文壇の重要人物を輩出。戦前戦後を通じてキリスト教主義教育の伝統を守り続けている。