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武蔵国多摩郡石田村（東京都日野市）の豪農・石田散薬の製造家に生まれ、行商しながら天然理心流の剣術を学んだ。近藤勇とともに1863年の浪士組に参加して上洛し、京都守護職・会津藩お預かりの「新選組」副長となった。自ら厳格な「局中法度」を起草し、違反者には切腹を命じる鉄の規律で隊を統率した。「鬼の副長」と恐れられる一方、俳句を愛する繊細な一面もあった。池田屋事件・禁門の変・第一次長州征討など幕末の激戦を乗り越えた。鳥羽・伏見の戦い（1868年）以降は旧幕府軍として転戦を続け、宇都宮・会津・仙台・函館と北へ退きながら最後まで戦い抜いた。榎本武揚ら旧幕府勢力とともに箱館五稜郭に入り、新政府軍の総攻撃を受けた1869年5月11日、一本木関門付近で銃弾を受け35歳で戦死した。土方歳三は函館の五稜郭に近い石田寺（日野市）に眠り、毎年命日には全国から多くのファンが訪れる。その壮絶な最期は今も幕末の象徴として語り継がれている。

冷徹な規律の鬼でありながら、俳句を嗜み洒落者でもあった。写真に残る端正な容姿と、最後まで武士として戦い抜いた生き様が後世の人々を魅了し続けている。

新選組を実質的に運営した組織者として、また最後の武士として箱館に散った悲劇の英雄として、小説・漫画・ドラマで最も人気のある幕末の人物の一人である。