生年不詳（1530年代半ば頃と推定）。遠江国井伊谷（現・静岡県浜松市北区）の国衆・井伊氏の当主の娘として生まれた。井伊氏は今川義元の支配下にあり、父・井伊直盛は桶狭間の戦い（1560年）で今川方として参陣し討死。その後も一族の男子が次々と謀殺・戦死し、井伊家は断絶の危機に陥った。直虎は出家して「次郎法師」を名乗っていたが、男子の当主がいなくなったため、女性の身で井伊谷の領主となり「井伊直虎」を名乗ったとされる。今川氏真や小野道好（但馬守）など周囲の圧力に耐えながら井伊谷を守り、一族の遺児・虎松（後の井伊直政）を養育した。直政は後に徳川家康の下で頭角を現し、「徳川四天王」の一人に数えられる名将に成長した。直虎は1582年（天正10年）8月26日に死去。直政が彦根藩の祖となり、井伊家は幕末まで大老を輩出する名門として続いた。2017年のNHK大河ドラマ「おんな城主 直虎」の主人公として全国的に知名度が高まった。