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1730年、伊勢国松坂（現・三重県松阪市）の木綿商・小津家の次男として生まれた。幼名・富之助。11歳で父を失い、家業を継ごうとしたが商才に乏しく、母の勧めで京都に出て医学を学んだ。1757年、28歳で松坂に帰り、医師を開業しながら古典研究を本格化。1763年、伊勢参宮の途中で松坂を訪れた賀茂真淵と一夜の問答を果たし（「松坂の一夜」）、入門。真淵から『古事記』研究を託された。以後35年間、昼は医師、夜は学者として『古事記』の全44巻の注釈『古事記伝』を1798年に完成（1764年着手）。主著『源氏物語玉の小櫛』では『源氏物語』から「もののあはれ」を日本文学の本質として抽出。神道思想を儒教・仏教の「漢意（からごころ）」から解放し、純粋な日本精神「大和心（やまとごころ）」を説いた。鈴屋（すずのや）と名付けた自宅書斎で学問を営む。1801年、72歳で松坂にて没。

温厚誠実にして謙虚な学者。日中は医師として町人の病を診て、夜は書斎「鈴屋」で古典研究に没頭する実直な生活を送った。町人・農民の娘であった妻・たみに先立たれながらも、50人以上の弟子を集め自宅で学問を講じた。「歌はしらべを貴ぶ」と自ら多くの和歌を詠み、『古今和歌集』の雅を愛した。儒教・仏教の形式主義を排し、「感じるままに、自然に」という日本人的情感を重んじる生き方を貫いた。

宣長の『古事記伝』は日本最古の歴史書を体系的に解読した金字塔で、国学・日本古代史研究の基盤となった。「もののあはれ」論は日本文学論の核心として以後も受け継がれ、芥川龍之介・川端康成ら近代文学者にも影響を与えた。平田篤胤を通じて復古神道・尊皇思想へ、さらには幕末の尊皇攘夷運動へと展開。明治以降は国家神道の思想的源流ともなった。一方、小林秀雄『本居宣長』（1977年）は宣長の文学論を現代的に再評価し、「日本的精神の原点」として位置付けた。鈴屋（松阪の旧宅）は現在、本居宣長記念館として保存されている。