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1861年（文久元年）3月26日、江戸・小石川に高崎藩士・内村宜之の長男として生まれた。東京英学校（現・青山学院）を経て、1877年（明治10年）札幌農学校（現・北海道大学）第2期生として入学。新渡戸稲造・宮部金吾らと同期で、農学士として首席卒業。在学中の1878年、メソジスト監督教会宣教師M.C.ハリスより受洗、キリスト者となる。同期生らと結んだ「イエスを信ずる者の誓約（Covenant of Believers in Jesus）」は日本におけるキリスト教集団誓約の原点。1884年渡米、アマースト大学でJ.H.シーリー総長の感化により深い回心を経験、1887年神学士の資格を得てハートフォード神学校で学んだ。1888年帰国後、第一高等中学校嘱託教員となる。1891年1月9日、同校の教育勅語奉読式において勅語への最敬礼を拒否（深く礼をしたが最敬礼ではなかった）、世に「不敬事件」として大問題となり、職を追われる。以後はフリーランスのキリスト者・著述家として活動、1893年『基督信徒の慰』、1894年『求安録』、1895年英文『How I Became a Christian』、1900年『聖書之研究』創刊、1908年英文『Representative Men of Japan』（『代表的日本人』）など重要著作を次々と発表。「無教会主義」を提唱、教会制度・聖職者・洗礼・聖餐式等に頼らず、聖書と信仰のみによる独自のキリスト教を展開。日露戦争（1904-05）時には非戦論を主張、社会主義者・幸徳秋水らと共闘した。晩年は「再臨運動」を唱え、キリストの再臨を待望した。1930年（昭和5年）3月28日、東京・柏木で心臓麻痺のため69歳で没。

剛直・熱烈・預言者的なキリスト者。権威に屈しない気概を持ち、国家主義全盛の明治において勅語不敬・日露戦争反対など反体制的立場を貫いた。一方で「武士道精神の上に接木されたキリスト教」を自負し、日本的キリスト者のあり方を模索した。文才に恵まれ、英文・日文両方で優れた著作を残した。弟子たちからは「キリスト者的武士」と呼ばれた。

内村鑑三の「無教会主義」は日本独自のキリスト教運動として世代を超えて継承され、矢内原忠雄・南原繁・塚本虎二・政池仁・関根正雄・浅見仙作・藤井武らの弟子を生んだ。『代表的日本人』は英文著作として西郷隆盛・上杉鷹山・二宮尊徳・中江藤樹・日蓮の5人を西欧世界に紹介し、新渡戸稲造『武士道』・岡倉天心『茶の本』と並ぶ「英文による日本紹介3部作」の一つとして国際的に評価されている。「二つのJ（JesusとJapan）」に生涯を捧げるという信念は、日本的キリスト教の原点。不敬事件はキリスト教と国家神道の対立を象徴する事件として近代思想史に深く刻まれる。