1561年、遠江井伊谷の井伊直親の遺児として生まれた。父が謀殺されたため井伊家は一時断絶の危機に瀕したが、徳川家康に見出されて仕えることになった。家康に最も寵愛された武将の一人で、武勇と知略を兼ね備え、「井伊の赤備え」と呼ばれる赤一色の鎧・旗指物で武装した精鋭騎馬隊を率いた。この赤備えは武田信玄の旧臣・山県昌景の部隊の伝統を受け継いだものであり、戦場で最も恐れられた部隊の一つであった。1600年の関ヶ原の戦いでは東軍の先鋒として活躍したが、戦後に旧・島津軍の落ち武者に銃撃されて重傷を負い、1602年に42歳で没した。徳川四天王（本多忠勝・酒井忠次・榊原康政）の一人に数えられ、戦後に近江彦根12万石を与えられた。彦根城は現存天守を持つ国宝に指定されており、現代も多くの観光客を集めている。