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土佐国高知（現高知市）の郷士・坂本八平の次男として生まれる。江戸に出て北辰一刀流の千葉道場に入門し剣の腕を磨いた。尊皇攘夷思想に傾倒していたが、勝海舟と出会って開国・海軍強化の必要性を確信し、幕府海軍の訓練所に参加した。1865年に長崎で亀山社中（後の海援隊）を結成し、貿易商社兼海軍塾として運営した。長年の宿敵であった薩摩藩と長州藩の間の対立を仲介し、1866年1月に薩長同盟の締結に成功した。この同盟は倒幕への決定的な推進力となった。同年に薩摩藩の蒸気船「夕顔丸」艦上で長崎商人の楢崎龍（おりょう）と日本初の近代的新婚旅行とも言われる旅を行った。1867年には大政奉還の建白書となった「船中八策」を起草し、徳川幕府の自主的な政権返上を促した。しかし同年11月15日、京都の近江屋において京都見廻組（あるいは新選組との説も）に暗殺され、31歳の短い生涯を閉じた。

藩や身分の枠を超えた自由な発想と行動力が際立つ。敵対していた薩摩・長州という巨大勢力を仲介できたのは、既存の利害や偏見に縛られない独自のビジョンと人懐こさのためだとされる。手紙に口語を多用するなど率直で飾らない文体も愛され、その人間的な魅力は現代の日本人にも強く訴えかける。

薩長同盟の仲介と大政奉還の構想という二大功績によって、明治維新の精神的象徴となった。現代日本における「坂本龍馬人気」は圧倒的で、NHK大河ドラマでも複数回主人公となり、高知龍馬空港など全国各地に名前が刻まれている。その自由・革新・脱藩の生き方は現代の起業家精神の原型として語られることも多い。