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京都市中京区、烏丸通錦小路上ルの町なかに残る井戸で、八坂神社（祇園社）ゆかりの霊水を湛える。この地はかつて祇園祭の御旅所が置かれた場所で、御祭神に毎朝この井戸の水を供えたと伝わる。普段は閉じられているが、祇園祭の期間中（7月中旬から下旬）だけ開けられ、参拝者が御神水を汲むことができる。

御手洗井のある一帯は、もとは祇園社の御旅所が置かれた地で、祭神の素戔嗚尊（牛頭天王）に日々この井戸の水が供えられていたと伝わる。水質に優れ、永禄11年（1568）に織田信長が御旅所を四条寺町へ移した後も、井戸はこの地に残され、祇園祭の期間中だけ開放される習わしが今に続く。井戸は八坂神社本殿下の井戸と通じるという伝承があり、土用にこの水を小豆餅とともにいただくと一年間病気をしないとも言い伝えられる。普段は鳥居と覆屋に守られて静かにたたずむが、祇園祭の祭礼を支える霊水として大切にされてきた。